Reséquençage ciblé

Lorsque tout ou partie du génome de l’espèce étudiée est connu, il est parfois pertinent de ne séquencer que certaines zones d’intérêt. Pour cela, il est possible soit d’amplifier des séquences cibles par PCR, soit d’hybrider des sondes spécifiques à ces zones d'intérêt. Plusieurs approches et technologies sont disponibles, chacune ayant ses caractéristiques, ses avantages et ses inconvénients.

 

Reséquençage via capture de gènes par hybridation en phase liquide (Agilent SureSelect, MYcroarray Mybaits, Roche NimbleGene)

 

Principe

Des sondes biotinylées ARN ou ADN de 60 à 120 bases sont utilisées pour capturer des régions d’intérêt. Mises en solution avec la librairie d’ADN, les sondes s’hybrident à leur cible. Les fragments d’ADN ciblés liés aux sondes sont capturés à l’aide de billes magnétiques couplées avec de la streptavidine ayant une forte affinité pour la biotine présente sur les sondes. L’ADN non ciblé est éliminé par des lavages successifs, alors que le complexe sonde-séquence cible est retenu par aimantation. Une courte amplification par PCR permet d’augmenter la quantité de séquences et de dégrader les sondes. Le séquençage peut se faire indépendamment sur MiSeq, PGM ou PROTON (selon le nombre de cibles et/ou d’échantillons).

Avantages

  • Capture de régions de grande taille allant jusqu’à 50 Mb
  • Tolérance aux polymorphismes : un panel de sondes peut être utilisé sur des espèces proches.
  • Technologie performante pour la capture des ADN anciens ou dégradés
  • Possibilité de saturer certaines régions en augmentant le chevauchement des sondes (tilling)

Inconvénients

  • Nécessite des librairies de bonne qualité
  • La tolérance des sondes peut entrainer une hybridation sur d’autres zones du génome (off-target)

 

Nimblegene

 

Reséquençage via capture de gènes par PCR (Ion Torrent AmpliSeq)

 

Principe

Technologie basée sur le multiplexage d’amorces (jusqu’à 24.500 par pool dans le panel Exome humain). Une PCR multiplex est réalisée, générant des amplicons entre 100 et 200 pb. Ces dernières vont être partiellement digérés pour permettre la ligation des adaptateurs nécessaire au séquençage sur PGM ou PROTON.

Avantages

  • Construction de librairies simple et rapide
  • Nécessite peu d’ADN au départ (10ng)
  • Panel utilisable sur beaucoup d'échantillons

Inconvénients

  • Nécessite un génome validé car la difficulté de cette approche réside dans le choix des amorces de PCR (il ne faut pas de polymorphismes dans les zones où elles s’hybrident).

 

Ampliseq

 

Reséquençage via Access Array 48.48 Fluidigm

 

Principe

Sur chaque cassette (48 échantillons), 48 paires d'amorces sont amplifiées indépendamment dans un réseau microfluidique puis combinées en sortie, générant un pool d’amplicons par échantillon. L’utilisation d’une queue universelle lors de cette PCR-1 permet d’ajouter les adaptateurs de séquençage et les barcodes spécifiques des échantillons lors de la PCR-2. Les librairies sont ensuite séquencées sur MiSeq, PGM ou PROTON (selon le nombre de cibles et/ou d’échantillons).

Avantages

  • Construction de librairies simple et rapide
  • Pas d’interaction entre paires d’amorces
  • Multiplexage possible (jusqu’à 480 amplicons générés pour chaque échantillon)
  • La taille de l’amplicon est uniquement limitée par la technologie de séquençage (jusqu’à ~500pb sur MiSeq et ~700pb sur PGM)

Inconvénients

  • Nécessite un génome validé car la difficulté de cette approche réside dans le choix des amorces de PCR (il ne faut pas de polymorphismes dans les zones où elles s’hybrident).

 

AccessArrayWorkflow

 

Crédits photos : ROCHE - Thermo Fisher Scientific