Targeted metagenomics

La métagénomique ciblée  (métabarcoding) permet d’établir un inventaire des organismes (bactéries, archées, eucaryotes) présents dans un milieu complexe (tissus, fèces, salive, échantillons de sol, eau, air, aliments...). Cette méthode, qui est une alternative à la culture d'échantillons en laboratoire, est basée sur l’analyse de l'ADN environnemental par séquençage haut débit (NGS) à partir de régions d’ADN ciblées, préalablement amplifiées par PCR.

L'analyse de métabarcoding ciblée par séquençage nouvelle génération (NGS) comprend plusieurs étapes. L'ADN total est tout d'abord extrait de l'échantillon puis le ciblage d'un marqueur informatif sur le plan taxonomique et commun à un groupe d'intérêt spécifique sera amplifié. Il est également possible d’analyser simultanément plusieurs marqueurs d’intérêt en multiplexage.

Les amplicons obtenus sont séquencés et analysés par bioinformatique pour déterminer quels sont les organismes présents dans l'échantillon et selon quelle abondance relative. 

 

Workflow métagénomique

 

L’extraction d’ADN à partir d’échantillons environnementaux peut être réalisée dans notre laboratoire spécifique ADNe.

La préparation des librairies consiste en la réalisation de deux PCR successives qui vont permettre d’amplifier la ou les région(s) ciblée(s) et d’y attacher de chaque côté les adaptateurs et index spécifiques pour chaque échantillon. Les différentes librairies ainsi créées vont ensuite être normalisées puis poolées en équimolaire avant d’être séquencées sur le MiSeq. Plusieurs kits de séquençage sont disponibles en fonction du multiplexage souhaité.

A noter qu'il est également possible de faire de la métagénomique ciblée sur séquenceur Ion Torrent PGM, avec des longueurs de lecture d'environ 500 pb.

 

Kits Miseq

Longueur des séquences

Nombre de séquences

(1 marqueur/96 éch.)

Nombre de séquences

(1 marqueur/384 éch.)

Nombre de séquences

(3 marqueurs/96 éch.)

Nombre de séquences

(3 marqueurs/384 éch.)

Kit Nano v2

2*250 pb

≈ 10 000

≈ 2 500

-

-

Kit Macro v2

2*250 pb

≈ 130 000

≈ 30 000

≈ 45 000

≈ 10 000

Kit Macro v3

2*300 pb

≈ 230 000

≈ 55 000

≈ 75 000

≈ 18 000

 

La PGTB vous propose de prendre en charge la préparation des librairies, le séquençage sur MiSeq et l'accompagnement à l'analyse des données avec Mothur (Schloss et al., 2009) ou à l'aide de pipeline développés en interne.

Crédits photos : Pixabay - Illumina - PGTB